O que é esse tal Sequenciamento Sanger?

O sequenciamento de DNA pelo método de Sanger nada mais é que uma eletroforese. Isso mesmo!

Mas não é qualquer eletroforese… 🧐

Os fragmentos de DNA são gerados previamente em uma reação bastante similar a uma PCR, porém, ao invés de copiarmos uma mesma região inteira do DNA, são feitas cópias de diversos tamanhos desta região, aleatoriamente.

Como isso é possível? O segredo está no ddNTP. 🤓

No tubo de reação, adicionam-se moléculas chamadas de dideoxinucleotídeos (ddNTP). Estas moléculas possuem um átomo de hidrogênio no carbono 3′ da pentose ao invés de uma hidroxila. Essa estrutura confere à molécula a capacidade de parar a extensão da fita de DNA quando o ddNTP liga-se ao seu nucleotídeos complementar.

Além desta característica peculiar, as bases nitrogenadas (A, T, C e G) dos ddNTP possuem um composto fluorescente ligado à sua estrutura. Cada uma das bases tem uma fluorescência diferente, fazendo com que seja possível identificar o nucleotídeo presente na posição onde a síntese da fita parou. 🧬

Os fragmentos de DNA que vão sendo gerados na reação similar a PCR (etapa de marcação), possuem diversos tamanhos, com pontos de parada da síntese contendo um ddNTP marcado: ddATP, ddTTP, ddCTP ou um ddGTP.

Então, os pedacinhos de DNA são separados por tamanho em um fino capilar, substituindo o gel da eletroforese que conhecemos bem. Fragmentos menores, com os primeiros nucleotídeos marcados, migram primeiro. Conforme as moléculas vão migrando pelo capilar, a fluorescência dos nucleotídeos em cada posição vai sendo lida pelo detector.

Assim, toda a sequência é revelada! 💡